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Carrier RNA 是片段在200 -3000 nt之间的RNA混合物,溶解于RNA保护剂(Simgen产品序号:4003230)中,浓度为6 μg/μl。
产品介绍
在柱纯化微量核酸的过程中,如病毒RNA纯化、病毒DNA纯化及微量DNA提取等实验,微量的核酸在纯化柱上的结合和洗脱效率降低,导致不能回收到足够的PCR模板,最终使检测失败。在柱纯化核酸纯化体系中添加Carrier RNA,可提高10倍以上微量核酸的回收效率,同时由于Carrier RNA的存在,还可特别保护微量的RNA模板,减少RNA酶的对微量RNA模板的攻击机率。Carrier RNA是微量RNA纯化(如病毒RNA纯化)中不可缺少的组成成份。
使用方法
在微量核酸纯化的每次纯化体系的裂解液中加入1-5 μl Carrier RNA。最后获得的含有Carrier RNA的微量核酸可直接用于PCR或RT-PCR反应。
Carrier RNA的存在对血浆游离核酸纯化效率的影响
实验目的:在实验中设计Carrier RNA的添加与否以探究其对小片段核酸纯化的回收效率的影响。
实验材料及设备:
血浆游离核酸纯化试剂盒(simgen)、Carrier RNA(simgen)、人血浆(购自浙江省血液中心)、无水乙醇、动物源性检测试剂盒(猪源)(simgen)
样本:猪源的扩增产物(引物Forward CGACAAAGCAACCCTCACAC;引物Reverse TGCGAGGGCGGTAATGAT长度为70 bp)用Buffer TE稀释10000倍后,再用人血浆稀释1000倍作为含有游离核酸的血浆样本。
设备:ABI 7000 荧光PCR仪、漩涡震荡仪、水浴锅、离心机及移液器
其他耗材:1.5ml离心管、八连排PCR管,RNase-free吸头,一次性手套及防护用品和纸巾。
实验方法:
1、 根据simgen血浆游离核酸纯化试剂盒的说明书的操作步骤,按照下列方案进行操作,提取DNA。
编号
试剂(μl)
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①②
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③④
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⑤⑥
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⑦⑧
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蛋白酶K
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20
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20
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80
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80
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体液样本
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200
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200
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800
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800
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Carrier RNA
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5
|
0
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10
|
0
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Buffer VL
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200
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200
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800
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800
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无水乙醇
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320
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320
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1280
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1280
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Buffer TE
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50
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50
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50
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50
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注:编号1─4为体液为200 μl时,且在Carrier RNA加与不加时对扩增的影响,同时将体液样品扩大4倍即编号5─8,探究Carrier RNA加与不加的影响。
2、 用simgen的动物源性检测试剂盒(猪源)配制PCR混合液,将取得的8管DNA按照5 μl/管加入到PCR反应体系混合液中,进行荧光PCR扩增,观察实验结果。
实验结果:
图1、200ul体液样本的扩增曲线
图2、800ul体液样本的扩增曲线
讨论与分析:
1. 从图1分析:加入Carrier RNA的1号和2号CT值比3号小约1.5个CT值;比4号小约3.5个CT值。说明该核酸纯化体系中,如果不含Carrier RNA,痕量核酸的回收效率会变得不稳定,是加入Carrier RNA的核酸纯化体系回收效率的1/10—1/3。
2. 从图2分析:加入Carrier RNA的5号和6号CT值比7号和8号小约3.3个CT值。说明该核酸纯化体系中,如果不含Carrier RNA,则会是加入Carrier RNA的核酸纯化体系回收效率的1/10左右。
3. 小片段(本实验是70bp)痕量DNA(pg级别)用柱纯化回收的过程中,Carrier RNA的加入,能显著提高回收效率。